رزین ها

رزین های مخصوص کروماتوگرافی:

هنگام بررسی نوع رزین کروماتوگرافی که بهترین پاسخگوی نیازهای شماست، چهار دسته رزین وجود دارد که باید بر روی آن‌ها تمرکز کنید. عواملی مانند خلوص، بار سطحی پروتئین هدف شما، اندازه مولکول، و حتی نحوه تعامل آب با نمونه شما، همگی در تعیین رزین ایده‌آل بسیار مهم هستند.بیایید به طور دقیق‌تر انواع خاص رزین را بر اساس تکنیک‌های مختلف کروماتوگرافی بررسی کنیم.

Affinity chromatography (AC)

این نوع بسیار دقیق کروماتوگرافی می‌تواند در یک مرحله به خلوص بالایی دست یابد. کروماتوگرافی وابستگی (AC) مولکول‌های هدف را با استفاده از یک تعامل قوی اما برگشت‌پذیر بین پروتئین نمونه و یک لیگاند خاص جدا می‌کند. این تعامل پیوندی لیگاند را به یک رزین ثابت می‌کند، به همراه ترکیب هدفمند.

اتصال و خالص‌سازی این تکنیک بسیار انتخابی است و از ساختار یا عملکرد زیستی پروتئین هدف بهره می‌برد. هر دو مولکول طبیعی و تولید شده به طور نوترکیب می‌توانند با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی خالص شوند – این را به یک روش چندمنظوره و دقیق انتخاب می‌کند.

Ion exchange chromatography (IEX)

کروماتوگرافی تبادل یونی با جداسازی مولکول‌ها بر اساس بار سطحی کلی آنها کار می‌کند. این برهم‌کنش همچنین قابل برگشت است و می‌توان آن را با تطبیق یک رزین کروماتوگرافی که بار مخالف ترکیب هدف در نمونه شما دارد، انجام داد.

رزین‌های تبادل یونی با اتصال کوواالنسی گروه‌های عاملی دارای بار مثبت یا منفی به یک ماتریس جامد ایجاد می‌شوند. برخی از رسانه‌های رایج‌تر مورد استفاده شامل سلولز، آگاروز، پلی‌متاکریلات، پلی‌استایرن و پلی‌آکریل‌آمید هستند.

یک نمونه پروتئین در یک ستون تبادل یونی (IEX) در قدرت یونی پایین بارگذاری می‌شود و سپس با بافرهایی با قدرت یونی رو به افزایش شسته می‌شود تا ذرات و ناخالصی‌های غیرمطلوب حذف شوند. پروتئین هدف سپس با استفاده از گرادیان‌های نمکی تعریف‌شده یا تغییر pH از ستون خارج می‌شود. هنگام انجام الوتیون با نمک، ممکن است نیاز به پردازش‌های بیشتری قبل از بارگذاری ستون باشد، در حالی که الوتیون با pH می‌تواند بدون این مرحله اضافی انجام شود. این به این دلیل است که قرار گرفتن در معرض تغییر pH باعث می‌شود پروتئین هدف دیگر بار خالصی نداشته باشد و آن را از رزین آزاد کند (با بهره‌گیری از نقطه ایزوالکتریک پروتئین هدف).

این تکنیک کروماتوگرافی برای هدف‌گیری آنتی‌بادی‌های مونوکلونال و همچنین به عنوان مرحله دوم خالص‌سازی پس از کروماتوگرافی وابستگی ایده‌آل است. علاوه بر این، رزین تبادل یونی با گلوله‌های بزرگ نقطه شروع مناسبی برای خالص‌سازی در ستون اول است.

Hydrophobic interaction chromatography (HIC)

این تکنیک پروتئین‌ها و سایر بیومولکول‌ها را بر اساس هیدروفوبیسیته سطحی آن‌ها جدا و خالص‌سازی می‌کند. این روش برای جداسازی و خالص‌سازی پروتئین‌ها در حالی که فعالیت بیولوژیکی آن‌ها حفظ می‌شود، مفید است. کروماتوگرافی هیدروفوبیک (HIC) از بافرها، ماتریس‌ها و پارامترهایی استفاده می‌کند که کمتر باعث دناتوره شدن نمونه نسبت به سایر روش‌ها می‌شوند – که این امر آن را برای آزمایش‌هایی که نیاز دارند نمونه‌ها دست نخورده بمانند و برای ویژگی‌های بیولوژیکی دیگر مورد بررسی قرار گیرند، ایده‌آل می‌سازد.

غلظت‌های نمک، pH و دما می‌توانند بر تعاملات پیوندی با محیط یا حتی شیمی لیگاندی که به رزین متصل شده است تأثیر بگذارند.

HIC به طور معمول در ترکیب با روش‌های تخلیص IEX با نمک بالا در بالادست و روش‌های تخلیص حذف اندازه در پایین‌دست استفاده می‌شود.

Size exclusion chromatography (SEC)

این روش کمی متفاوت از یک محیط ژل برای تفکیک پروتئین‌ها بر اساس اندازه آن‌ها استفاده می‌کند. در این تکنیک، مولکول‌ها به رزین کروماتوگرافی متصل نمی‌شوند، بلکه از طریق فیلتراسیون ژل عبور می‌کنند.

ژل SEC از گلوله‌های کروی تشکیل شده است که حاوی منافذی با اندازه مشخص هستند تا مولکول‌ها را در رسانه خود جای دهند یا از آنها خارج کنند. جداسازی هنگامی رخ می‌دهد که نمونه از داخل ستون عبور می‌کند و به ترتیب کاهش وزن مولکولی خارج می‌شود.

جداسازی و حذف نمک/تعویض بافر دو روش رایج ترین SEC هستند. این تکنیک‌ها زمانی استفاده می‌شوند که روش‌هایی مانند IEX یا HIC پروتئین‌ها را به میزان لازم خالص نمی‌کنند. SEC اغلب به عنوان آخرین مرحله در خالص‌سازی پروتئین استفاده می‌شود.

Multimodal chromatography (MM)

کروماتوگرافی حالت مخلوط به طور رایج به عنوان یک مرحله تصفیه در خالص‌سازی بیومولکول‌ها استفاده می‌شود. این روش از رزین‌های عملکردی با لیگاندهایی که قادر به تعاملات چندگانه هستند، استفاده می‌کند و این ویژگی باعث می‌شود که این روش برای خالص‌سازی مولکول‌های هدف بدون خاصیت مشخص مفید باشد.

این تکنیک می‌تواند برای غربالگری، خالص‌سازی و شناسایی بالقوه مناطقی در یک پروتئین هدف که می‌تواند اطلاعات مفیدی در مورد میل ترکیبی و انتخابی فراهم کند، استفاده شود.

تنها محدودیت این روش این است که تعامل هدف نمی‌تواند از طریق تحلیل ساده توالی اسیدهای آمینه پیش‌بینی شود، زیرا ویژگی‌های متعددی برای اتصال و شستشو وجود دارد. این امر نیاز به مراحل اضافی از آزمایش‌های اولیه بر روی شرایط اتصال و شستشو دارد.

مزیت کلیدی کروماتوگرافی MM ترکیب روش‌های کروماتوگرافی مکمل در حالی است که از یک محیط واحد استفاده می‌شود. این می‌تواند مراحل تصفیه را صرفه‌جویی کرده و استفاده از مواد نمونه ارزشمند را به حداقل برساند. در برخی موارد، این می‌تواند نتایج سریع‌تری را نیز فراهم کند – به‌ویژه برای ناخالصی‌های محصول که از نظر ساختار به مولکول هدف مشابه هستند.